WB 实验常见问题及问题排除 - 一抗专题(GeneTex) - 18bet开户
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WB 实验常见问题及问题排除

2021-06-23
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WB 实验结果有黑点
原因解决方案
封闭液未溶解完全a. 确认奶粉完全溶解。出现黑点最常发生的原因是奶粉没有完全溶解,建议加入搅拌子,增加搅拌时间,或是溶解后离心取上清液使用。
b. 
利用0.45 um的滤纸过滤溶液,以除去未溶解的牛奶颗粒及其他杂质。
c. 
改变封闭液的种类,如换为BSA
溶液污染a. 使用新鲜配制的溶液 (跑胶、转膜、封闭、洗脱等缓冲液)或商业化溶液,以减少因长菌长霉造成的黑点。
b. 
确认一抗溶液是否保存不当,可尝试重新配置一抗溶液。
封闭液及抗体交互作用一般脱脂牛奶中含有casein这种磷酸蛋白,可能会与磷酸化抗体产生非特异性结合,因此,如使用磷酸化抗体,建议用BSA作为封闭溶液,同时洗脱溶液也用TBST,如此可降低黑点或高背景值状况。
注:a. TBST是以Tris为基底,PBST是以磷酸盐为基底的缓冲液,一般根据习惯选择使用TBSTPBST。但如果是操作磷酸化抗体或最终显色分析是用AP系统时,因为PBST中的磷酸根会干扰,可能会造成高背景值或无信号,此时建议使用TBST缓冲液。另外,同一次实验中请使用一种缓冲液,不可封闭液用PBST,洗脱液用TBST
b. 
封闭时一般使用3-5%封闭溶液,依实验特性不同,可做微调;牛奶与BSA的选择也是相同,掌握原则后,再依实验特性做微调,就能快速上手。
WB实验结果信号过曝
原因解决方案
蛋白样品过量降低蛋白上样量。通常蛋白上样量为30-50 ug,但有些蛋白的表达量较高(如beta actin),此时可依蛋白表现量,调整上样量。
抗体过量a. 提高抗体稀释倍数。产生过曝时可提高一抗、二抗的稀释倍数。
b. 
减少孵育时间
c. 
4℃孵育
信号过曝a. 缩短曝光时间。过曝时可缩短曝光时间,减少过曝的情形。
b. 
使用低灵敏度的化学发光底物。过曝现象也有可能是因为化学发光底物过强导致的可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。
注:化学发光底物一般有三种等级,femto(飞克, 10-15g), pico(皮克, 10-12gplus(低皮克级, 10-12~ 10-9g),可依蛋白表达量挑选适合的化学发光底物。
WB实验结果拖带
原因解决方案
样本不纯,有杂质污染a. 重新离心样品后取上清液使用
b. 
使用较纯的试剂配置细胞裂解液或购买商业化产品
c. 
使用Benzonase®核酸酶。Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸,降低蛋白样品粘度,减少核酸对跑胶的干扰
d. 
全细胞或亚细胞萃取。使用商业化全细胞或亚细胞萃取试剂盒提取蛋白样品,减少配制试剂溶液以及操作中分离不干净的问题。
蛋白样品过量a. 降低蛋白上样量。通常蛋白上样量为30-50ug,但有些蛋白表达量较高(beta actin),此时可依蛋白表达量,进行微调。
b. 
延长加热时间。蛋白变性不完全也会使条带成团拖尾,此时可通过延长样品加热时间(一般约5分钟)及调整SDS(一般是2 %)比例使蛋白变性更完全。
信号过曝a. 缩短曝光时间。过曝时可缩短曝光时间减少过曝的情形。
b. 使用低灵敏的化学发光底物。过曝现象可能是因为化学发光底物过强导致的可选用灵敏度较低的化学发光底物来改善。
WB条带扭曲
原因解决方案
胶没配置好a. 确保APS & TEMED 正常并新鲜配置胶体。
APS
为起始剂,主要负责提供自由基供胶体进行聚合反应, APS粉末容易受潮,建议置于防潮箱保存,如果发生结块,建议重新购买。TEMED为催化剂,如果保存不当或过期,也会影响胶体聚合,建议分装。
b. 
小心移除齿梳,避免造成加样壁孔歪斜
c. 
配完下层胶后,需用水或醇类将胶体压平
d. 
胶里面有杂质/气泡。可预先用0.45 um滤纸过滤胶体溶液,混合胶体溶液时,应避免产生气泡。
电流电压问题a. 避免用高电压电泳使胶体过热。 150V,过热有雾气,80-100V,上胶带短、下层不匀。
b. 
空的孔道加样品缓冲液,使每个孔洞都有样品且盐类成分相近。
c. 
避免孔洞中有杂质,用高纯度等级的化学药品或用商业化试剂提取蛋白样品,或在上样前用跑胶缓冲溶液冲洗加样孔。
转膜问题a. 胶体应与膜密合,转膜时小心滚压胶体,使胶体与膜贴合紧实
b. 
转膜时小心勿晃动。有时出现 2个条带是因为转膜时发生晃动,产生叠影
条带呈哑铃状
出现哑铃最大的可能是胶没有配置好,胶凝固后不均一,拔完梳子之后,某些孔道凸起不平整,可以试着注意胶体是否凝固完全(确认试剂没问题),拔梳子时注意不要让孔道歪掉,loading前也可以再用running buffer冲洗孔道,另外还有一种可能是样品中含有太多杂质,没有离心下来,或没有溶解,然后杂质沉积在孔的中间,蛋白因此被推挤到两边。
条带呈哑铃状原因:出现哑铃状最可能是胶没有配制好,胶凝固后不均,拔完齿梳之后,某些孔道凸起不平整,另一种可能是样品中含有过多杂质,没有离心下来,或没有溶解,导致杂质沉积在孔的中间,蛋白因此被推挤到两边。
解决方案:确认胶体是否凝固完全,拔齿梳时注意不要让孔道歪斜,上样前可再用跑胶缓冲液冲洗孔道。
WB背景值较高
原因解决方案
封闭不足a. 提高封闭液浓度,确保封闭液完全覆盖转印膜,如使用5% 脱脂奶粉或BSA
b. 
增加封闭时间,一般情况会使用37℃封闭1小时,可视情况调整封闭的条件。
c. 
使用BSA作为封闭液,同时搭配使用TBST的洗脱液来降低高背景值的状况。
抗体问题a. 抗体浓度太高。建议降低抗体浓度,并增加洗涤次数和时间。
b. 
一抗孵育温度过高,建议4℃孵育过夜。
c. 
二抗的非特异性背景,可增加二抗对照,以阳性对照组确认二抗。
d. 
洗脱不足,增加洗脱液体积和洗涤次数。
显色问题化学发光底物过多,建议调整化学发光底物,按说明书加入适量的显色底物。也可依据蛋白表达量的不同,选择合适的化学放光底物。
膜的问题a. 挑选合适的NCPVDF膜。依据靶标蛋白、想要呈现的实验结果及膜的特性,选择出适合实验的材料。
b. 
建议实验过程中都必须注意让膜保持湿润,特别是PVDF膜。
c. 
在使用PVDF膜时可能会出现浸润不均匀的情况,从而导致背景值比较高的情况。因此,建议使用PVDF膜前使用100% methanol完全浸润膜。
WB条带非专一性
原因解决方案
蛋白质降解a. 蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂
b. 
冰上操作
c. 
避免反复冻融
蛋白质形成多聚糖a. 使用现配的DTT/2-ME,并将加热时间延长
b. 
确认样本煮沸时的温度达到95-100
确认蛋白质特性查询生物信息确认蛋白是否存在后修饰、剪切体等。
抗体浓度过高或蛋白样品过量a. 调整蛋白上样量为30-50 ug或减少上样量
b. 
增加抗体稀释倍数
抗体非专一性结合a. 增加洗膜次数与除垢剂强度
b. 
设对照组确认抗体专一性
c. 
询问抗体公司技术支持
抗体认到轻重链的信号a. 换不同宿主来源的一抗
b. 
使用EasyBlot二抗
目标信号微弱
原因解决方案
蛋白问题a. 了解靶标蛋白的特性
Ø 
是否存在特异性可提取特定细胞器增加蛋白浓度,例:抽取核蛋白、膜蛋白、胞质蛋白。
Ø 
是否存在组织特异性有些目标蛋白只会在特定组织表达,这可降低样本挑选的错误率。
Ø 
是否有后修饰作用目标蛋白后修饰分子量会变大,使抗体认到的位置比估算分子量高。
Ø 
确认靶标蛋白在细胞株的表达量以及是否需加药诱导蛋白表达。
b. 
增加蛋白质上样量。一般蛋白上样量为20-30μg/如文献已表明靶标蛋白表达量低或是使用极少的上样量(例如< 10μg),需增加上样量来协助抗体侦测其信号。
c. 
减少蛋白降解。
Ø 
细胞萃取时要加蛋白质抑制剂或磷酸酶抑制剂,避免蛋白降解。
Ø 
在冰上操作蛋白质实验。
Ø 
避免反复冻融样品(建议分装)
Ø 
新鲜制备新一批的样本。
抗体问题a. 调整抗体孵育条件。
Ø 
增加抗体量,例如原本使用1:1000稀释,调整为1:500稀释。
Ø 
增加孵育时间:将原37℃孵育1小时改成4℃孵育过夜。
b. 
一抗二抗不相容。检查二抗与一抗种属是否有正确配对,要诀:鼠配鼠兔配兔,isotype相配不出错
c. 
过度洗脱。减少洗脱次数与时间:一般洗脱三次每次5-10分钟即可。
转膜问题a. 检查转膜方向。转膜方向错误会让蛋白往反方向移动散逸在转膜缓冲液里,方向正确才能让蛋白粘附咋转印模的孔洞里。
b. 
根据分子量调整转膜条件。大分子蛋白转膜条件可调整为低温过夜(湿式转膜),小分子蛋白改用0.2 um的转印膜,缩短转膜时间。
封闭过度a. 降低封闭液浓度:一般使用3-5%的牛奶或BSA做封闭液即可。
b. 
降低封闭时间:一般封闭时间为30-60分钟。
c. 
换封闭液,可使用商业化封闭液(GTX30963)可协助避免这个问题的发生。
化学发光底物失活或敏感度不够a. 使用现配的化学发光底物
b. 
使用高敏感度的化学发光底物,例如使用飞克(GTX14698)等级的化学发光底物。
c. 
增加曝光时间



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